1861 年进入哈佛大学劳伦斯理学院在埃利奥特（Charles W. Eliot）指导下攻读化学，后又改学比较解剖学和生理学三年。在这期间，他的老师怀曼（Jeffies Wyman）的进化论思想对他以后的学术观点产生了直接的影响。又因听著名动物学家阿加西斯（Louis Agassiz, 1807－1873）的课，使他的兴趣从化学转向生物科学。1864 年，詹姆斯转入哈佛医学院学医，1865 年还未毕业便随同阿加西斯去巴西进行自然考察。1867 年去德国留学，在赫尔姆霍茨、冯特、微尔和的指导下学习医学、生理学和心理学。1869 年获哈佛大学医学博士学位。 1872 年开始在哈佛大学讲授解剖学和生理学，由于研究神经生理以及与心理学有关的其它生理学问题，他逐渐转向心理学的研究。1875 年他在美国第一个开设新心理学课程“生理学与心理学的关系”，并设立了一个非正式的心理学实验室。1876 年任哈佛大学生理学副教授。1880 年转任哲学副教授。1885 年升任哲学教授。1889 年转任心理学教授。次年出版两卷本着作《心理学原理》，几乎概括整个十九世纪的心理学，被翻译为法文、德文、意大利文以及俄文。该书既是当时实验心理学研究成果的基本总结，又是詹姆斯机能主义（或实用主义）心理学思想的集中体现。1892 年他把《心理学原理》改写为《心理学简编》，在美国被作为大学标准课本。

    他是美国心灵学研究会（1885 年成立）的主要创立者，终其一生都在探讨超个人的心理现象与超心理学，认为人的精神生活有不能以生物学概念加以解释的地方，可透过某些现象来领会某种“超越性价值”；并强调人有巨大的潜能尚待开发，人的意识只有很少一部分为人所利用。他曾参与类似禅坐的静坐活动，表示静坐是一种唤起深度意志力的方法，可以增加个人的活力与生命力，也做灵媒的实证研究。此外，詹姆斯横跨哲学、心理学与精神医学界，对超意识的自动书写很感兴趣，曾大量收集案例，并发现青少年最能借此表达内心的纠葛与人格之冲突，他还注意到自动书写有时能解开罪犯的犯罪症结，但并非人人能自动书写，必须透过催眠或其它方法。